食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定

　　黄曲霉毒素是当前食品中污染最严重的真菌毒素之一，各国及相关国际组织都对黄曲霉毒素设定了严格的限量标准，我国在《GB 2761-2017食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定了谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品及特殊膳食用食品等食品中的黄曲霉毒素B1的限量。目前测定食品中黄曲霉毒素B族和G族的食品安全国家标准为GB 5009.22-2016，标准于2017年6月23日开始正式实施。本次主要解读该方法的适用范围、基本原理、操作注意事项及结果判定注意点。

标准适用范围与基本原理
　　标准规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的测定方法，共包括5种方法，即同位素稀释液相色谱串联质谱法、高效液相色谱-柱前衍生法、高效液相色谱-柱后衍生法、酶联免疫吸附筛查法、薄层色谱法，且标准中5种方法的适用范围和测定组分有所不同。方法基本建立在乙腈水溶液或甲醇水溶液提取后，并在磷酸盐缓冲溶液介质下通过免疫亲和柱净化富集。

实验过程操作注意事项
　　试样制备。试样制备前要注意检验样品、复检样品的包装个数和总量是否满足标准要求。要重点关注采样数量：液体样品＞1L，对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装（同一批次或号），将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后，对其中任意的100g (mL)样品进行检测；固体样品＞1kg，用高速粉碎机将其粉碎、过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用；半流体＞1kg（L），对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装（同一批次或号），用组织捣碎机捣碎混匀后，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。另外，坚果及籽类样品如带壳，需注意去壳后可食用部分的量要达到1kg，且注意样品粉碎均匀。
　　标准储备液制备。一是选择用固体标准品配制标准储备液，临用前须进行浓度校准（校准方法参见附录A）。二是选择购买资质齐全的成品液体标准品，至少要购买两个来源的标准品，可进行比对，考察是否存在显著差异。三是标准储备液在-20℃下避光保存。
　　供试品溶液制备。样品前处理，一是采用超声波/涡旋振荡器或摇床充分振摇保证样品充分浸润，避免样品结块导致提取效果不佳，尤其是小麦粉、玉米粉等粉末样品。二是提取完成后高速离心或者用玻璃纤维滤纸过滤提取液，应保证上清液（滤液）澄清，小麦粉、玉米粉、食用油等样品建议采用高速离心充分分层。三是注意免疫亲和柱的使用，仔细阅读理解操作要求，按规定条件存放并关注其有效期，使用前检查其外包装是否完整，观察每一根免疫亲和柱内的保护液有无流失；另外，要依据标准附录B进行验证，包括柱容量、柱回收率、交叉反应率等。四是上样、淋洗过程中要控制好流速，流速过快或者过慢均容易造成检测结果偏低或者回收率偏低，特别要注意的是甲醇洗脱前需要将柱子充分抽干。五是要注意黄曲霉毒素含量高的样品，结合标准中黄曲霉毒素B1柱容量≥160ng的要求，考虑亲和柱可能过载问题，可减少取样量或上样体积。六是洗脱液氮吹环节要注意控制近干，完全吹干可能会造成检测结果偏低或者回收率偏低，有文献称洗脱液在氮吹前加入少量丙三醇能解决这一问题。六是针对豆制品（腐乳、豆豉等）、调味品（辣椒酱、豆瓣酱、花椒、胡椒和辣椒等）样品，基质复杂、干扰多，可以固相净化柱和免疫亲和柱同时使用以实现净化完全。
　　仪器分析系统。以柱后光化学衍生为例，分析系统流动相是水：甲醇-乙腈（50+50）溶液=68:32，荧光检测器激发波长为360nm，发射波长为440nm。一是针对检测信号响应低的问题，首先要确认光化学衍生器正常开启。黄曲霉毒素进入荧光检测器前的光化学衍生环节至关重要，尤其是标准曲线的低浓度点，未经光化学衍生基本无响应。标准检测方法的定量限达到0.1μg/kg的水平，按标准前处理其上机测试浓度为0.1ng/mL，极低的测试水平对检测仪器提出了极高的要求，不同仪器的荧光检测器灵敏度高低不同，在实验室内部尽量选择用灵敏度高、响应好的仪器进行检测，最好专机专用。如果现有仪器不能满足响应要求，在保证分离效果及色谱峰峰形的前提下可以加大进样量以达到响应要求。二是针对豆制品、调味品等复杂样品的杂质色谱峰干扰大、基线不平等问题，除了在前处理环节增加净化步骤，还可以在色谱分析过程中采取梯度洗脱程序，延长目标物色谱峰的保留时间，使目标物与杂质分离完全，消除干扰。
　　实验室安全操作。黄曲霉毒素属于致癌物，应避免于身体直接接触，操作时请注意穿戴好手套、口罩、实验服等。实验室整个分析过程应在指定区域内进行，该区域应避光（直射阳光）、具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。标液配制和加标回收所用到的实验器具、操作手套等均要在10%次氯酸钠水溶液浸泡半天。
　　过程质量控制要求。黄曲霉毒素类检测时，较为关键的是做好免疫亲和柱的验证，要注意空白控制，可采取加标回收、基体质控样来进行过程控制评价，最好储备多食品基质、多浓度水平的质控样。

结果判定和风险分析
　　目前GB 2761中只涉及黄曲霉毒素B的限量，监督抽检判定要严格按照附录A食品类别进行判定，特别注意的是食用植物调和油、芝麻酱等产品暂不能依据GB 2761进行不合格判定，但新征求意见稿中纳入了芝麻酱中黄曲霉毒素B的限量。结合抽检信息发布，常见有花生油（土榨）、花生米、花生酱等产品黄曲霉毒素指标不合格，另外也要注意香辛料、酱类等黄曲霉毒素B1污染的风险，还要注意对多种真菌毒素同时污染的监控。黄曲霉毒素指标不合格的原因可能是气候环境因素，原料易于富集真菌毒素；企业采购时未严格挑拣原料并进行相关检测，或原料的采收和储运条件控制不当，也会导致产品受到黄曲霉霉菌污染；产品加工过程中工艺控制不当或精炼程度不够也是食品污染黄曲霉毒素的原因之一。今年2月22日开始实施的GB 31653-20210《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素污染控制规范》中规定了在采收、储存前处理、储存、运输、加工等环节过程中控制食品中黄曲霉毒素的基本要求和管理准则，必要时也可采用快速检测方法对原料和过程加以监测。

□四川省食品检验研究院　夏玉吉 余晓琴