动物源性食品中瓜尔胶的测定（BJS 202301）解读

　　“注胶肉”是将食用胶和水的混合液注入动物体内，利用胶的凝固性将水分“锁”住的肉类。有的屠宰户在注胶的同时，还加入一些食盐和防腐剂，以延长肉的保质期；更有一些不法商贩将卡拉胶、瓜尔胶等胶体与血水及一些化学物质注入肉里，使注胶肉比注水肉更难识别。胶水的成本低廉，制备“注胶肉”属于欺诈行为，灌注的胶水中往往掺杂了防腐剂，会导致致病微生物污染、外来物质污染、重金属超标等风险，危害食品安全。
　　常见的食用胶有卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶等，其中瓜尔胶是一种具有较强增稠效果的亲水性胶体，属于半乳甘露聚糖（Galactomannan，简写为GM，又称半乳糖甘露聚糖），半乳甘露聚糖还包括田菁胶、刺槐豆胶、葫芦巴胶、刺云豆胶等。瓜尔胶相较于其他几种半乳甘露聚糖，具有来源广泛、价格低廉、黏稠度高等特性。此外，低浓度的瓜尔胶在冷水中即可形成稳定的高黏稠溶液，而刺槐豆胶等在冷水中不能完全溶解，需加热并保持一段时间才能充分水化，使冷却后达到最大黏度。因此，使用较少量的瓜尔胶在冷水中即可达到较好的保水效果，相较于其他半乳甘露聚糖胶，在非法注水过程中，用量更小、使用更方便的瓜尔胶应用也更为广泛。

方法原理
　　瓜尔胶属于半乳甘露聚糖，半乳甘露聚糖主链由D-甘露糖单元通过β-1, 4糖苷键连接而成，D-半乳糖作为支链不均匀地与主链通过α-1, 6糖苷键相连。β-甘露聚糖酶(β-Mannanase)是一类能够酶解含有β1, 4-D-甘露糖苷键的甘露多糖的水解内切酶，只能切断半乳甘露聚糖主链的β-1, 4糖苷键，而对通过α-1, 6糖苷键相连的支链半乳糖没有酶解作用。因此，半乳甘露聚糖在β-甘露聚糖酶作用下，会产生形成2~10个单糖单元通过糖苷键连接起来的半乳甘露低聚糖（galacto-mannan-oligosac -charides，GMOS）。本标准选用其中的3个单糖单元结构的瓜尔胶酶解产物特征寡糖作为目标化合物，样品经β-甘露聚糖酶55±5℃下酶解至少7 h，加入乙腈沉淀蛋白后离心，上清液经过中性氧化铝柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定。

操作要点
　　1.标准溶液的配制。在配制瓜尔胶溶液时，用水溶解混匀，为悬浊液，临用现配，使用时再次摇匀。
　　2.水解方式选择。瓜尔胶的水解有酶解、热解、酸解、辐照、微波与超声等多种方式，酶解、酸解的应用最为广泛。本方法选用酶解法，经过对酶解条件的优化，采用β-甘露聚糖酶在McIlvaine缓冲溶液，在55 ± 5℃水浴振荡下酶解7 ~16 h，冷却后沸水浴10 min灭酶活后，加入乙腈稀释、沉淀蛋白，待净化。
　　3.净化方式的选择。样品在提取过程中虽会去除大部分的脂肪、蛋白等干扰物质，但提取溶液中仍含有大量的杂质，会在后续的检测过程中产生明显的基质效应，对于基质效应严重的目标化合物还需进一步净化。相较于液液萃取等净化方式，固相萃取柱（SPE）的净化方式可以有效保留目标物，去除杂质，而且操作快捷，因此选取固相萃取柱对其进行进一步富集、除杂。基于特征寡糖极性弱、易溶于水、不易溶于有机溶剂的性质，实验选取的中性氧化铝SPE小柱可以有效去除样品中的脂肪和蛋白质，能够明显降低基质效应，实验结果表明，其对特征寡糖有较好的净化效果，因此本方法选取中性氧化铝固相萃取柱作为净化小柱。
　　4.定容溶剂的选择会影响目标化合物的峰型和离子化效率，因此需对定容溶剂进行优化。经过净化后，溶液为水系，可以通过增加有机溶剂比例以达到提高目标物的离子化效率的目的。经比较不同有机溶剂，乙腈不仅可以沉淀蛋白，提高净化效果，且与色谱流动相保持一致，起到改善峰型的作用。经研究，乙腈体积分数约为40 %~60 %时，离子化效率高，相对含量最高，且峰型良好。
　　5.基质效应。通过绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线，按照[(基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率）/溶剂标准曲线的斜率]×100 %来评价畜肉的基质效应大小。本实验的基质效应会对实验结果产生影响，需通过基质曲线来校正基质效应的影响。因此，本实验通过配制基质标准曲线来扣除基质带来的影响。
　　6.定量测定。瓜尔胶酶解得到的半乳甘露低聚糖中三糖响应值最高，因此方法中选用527.1瓜尔胶酶解产物特征寡糖用于质谱MRM检测，其分子式为C18H32NaO16 +，推断其酶解三糖应为两种构型，因此会有两个色谱峰。定量计算时，应将两个特征寡糖的色谱峰合并计算。

标准常见问题及注意事项
　　空白基质的选择：在同一批次进行多种基质样品检测时，可能会出现不确定选用哪种基质作为阴性样品配制基质曲线的情况，实验中通过比较肉类基质曲线的线性关系，选取了猪肉、牛肉、羊肉三种空白基质制作基质标准曲线，结果表明不同基质的标准曲线相差较小，因此实验过程中选取一种基质进行曲线的制作即可完成样品的检测工作。

社会风险评估
　　本方法检测的瓜尔胶为半乳甘露聚糖结构，方法中采用β-甘露聚糖酶酶解，获得半乳甘露低聚糖，采用液相色谱串联质谱法进行酶解产物特征寡糖检测，且以同步酶解的含基质的标准品瓜尔胶进行定量，检测的技术路线合理，定量结果可靠、准确。
　　利用本标准建立的检测方法对48件市场购买的样品及84件采自屠宰场无注胶的畜肉样品进行检测，并通过空白基质加标及阳性样本对方法的准确性进行确认。实验结果表明，所测132件样本中均没有检出特征寡糖，空白基质加标及阳性样本中特征寡糖峰形良好。结果表明，在畜肉基质中没有特征寡糖本底存在。因此，当样品中检出酶解产物特征寡糖时，来源可能为非法注入的瓜尔胶或其他结构相近的胶，建议监管部门以检测结果作为线索，进一步加强监督管理。

□中国肉类食品综合研究中心　郭 超 王娟强